1 范圍
本標準規定了牛胚胎移植的主要技術。包括供體牛選擇、超排處理、人工授精、胚胎收集、受體牛準備、移植、妊娠診斷等。
本標準適用于通遼地區養牛場(戶)。
2 規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
NY/T 815 肉牛飼養標準
DB1505/T 065 科爾沁肉牛獸醫防疫準則
DB1505/T 067 牛冷凍精液人工授精技術規范
DB1505/T 074 牛妊娠診斷規程
3 術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
3.1 供體
提供胚胎的母牛。
3.2 受體
接受胚胎并代之完成妊娠、分娩、哺乳犢牛的母牛。
3.3 同期發情
同期發情又稱同步發情,就是利用某些激素制劑人為地控制并調整一群母畜發情周期的進程,使之在預定時間內集中發情。
3.4 超數排卵
在母牛發情周期的適當時期,注射促性腺激素,使卵巢上比自然生理狀態下有更多的卵泡發育并排卵的方法簡稱“超排”。
3.5 沖胚
利用沖卵液將胚胎沖出,并收集在器皿中。
3.6 檢胚
指對沖出的胚胎的完整性、活力進行形態學檢測并鑒定等級。
4 供體牛的選擇標準
4.1 譜系清楚,生產性能優良,種用價值高。
4.2 繁殖性能良好,有連續2個或2個以上正常發情周期。
4.3 營養狀況好,膘情中上等。
4.4 無生殖系統疾病和傳染性疾病。
4.5 與配種公牛必須是經過后裔測定的優秀個體,育種值排名靠前。
5 受體牛的準備
5.1 受體牛選擇
可選擇生長發育正常、健康無病、乳房發育良好、繁殖力較強、體格適中的母牛,最好是經產母牛。
5.2 組群
5.2.1 外購受體牛應來自非疫區,并經獸醫部門檢疫合格的健康空懷母牛。
5.2.2 外購母牛隔離、免疫、驅蟲執行DB1505/T 065。
5.2.3 受體牛佩戴耳標。
5.3 受體牛的飼養管理
5.3.1 受體牛的飼養標準參照NY/T 815。
5.3.2 詳細觀察受體牛的日常行為、發情狀況、健康狀態。
5.4 受體牛的同期發情
5.4.1 受體牛的發情時間與供體牛超排后的發情時間應確保一致,前后不超過1d。
5.4.2 同期發情方法
前列腺素(PGF2α)法:一次注射法是在發情周期的第9d注射PGF2α,通常在2d~3d內發情。在不清楚發情周期的情況下采用兩次注射法,即第一次注射后間隔10d~12d再進行第二次注射。約90%于注射后24h~48h發情。
孕激素法:每日肌注或口服孕酮類似物如氯前列烯醇(PGC)2ml或0.2mg。處理12d~18d,停藥2d~3d后出現發情。
5.4.3 受體牛發情鑒定方法與供體牛相同。
6 供體牛的超排處理
6.1 通常采用促卵泡素(FSH)+前列腺素(PG)法。
6.2 程序
供體牛發情后的第9d~13d 肌注FSH,以日遞減法連續注射4d,每天早晚等量注射2次(每隔12h),使用總劑量按照牛的體重、胎次作適當調整。詳見表1。
表1 發情9d~13d超排處理及藥物劑量表
激 素 |
產 地 |
起始注射量(mg) |
連續注射4d每日遞減(mg) |
|
經產牛 |
育成牛 |
|||
FSH |
國產 |
8~10 |
6~8 |
0.2~0.4 |
進口 |
300~400 |
200~300 |
20 |
表1(續)
PG 氯前列烯醇 |
肌注 |
注射FSH 5~6針后 |
0.4~0.6 |
子宮灌注 |
注射FSH 5~6針后 |
0.2~0.3 |
超排藥品的劑量和比例應根據不同廠家和批號作調整。
7 供體牛的人工授精
7.1 發情鑒定
供體牛超排處理后,一般12h~48h出現發情征兆。發情鑒定執行DB1505/T 067。
7.2 配種
執行DB1505/T 067。
8 胚胎收集
8.1 方法
采用非手術法。
8.2 準備
8.2.1 回收胚胎在配種后6d~8d進行。沖胚前一天開始停飼并限制飲水,以減輕沖胚操作時腹壓和瘤胃壓力的影響。
8.2.2 準備好沖胚器械和沖卵液。沖卵液使用杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBSS),其成分和配方見附錄A。
8.3 供體牛的保定與消毒。
保定供體牛,用2%鹽酸利多卡因或普魯卡因進行薦尾椎硬膜外麻醉,用18號針頭,每頭牛約5ml。應將外陰部及陰唇清洗消毒,再用消毒過的紙巾擦干。
8.4 胚胎回收
8.4.1 固定沖卵器
供體牛尾部麻醉后,操作者一只手伸入直腸握住子宮頸,另一只手持內管穿插有金屬探針的雙通式或三通式導管沖卵器,使其依次通過陰門、陰道、子宮頸和子宮體,最后頭部抵達一側子宮角的基部。然后通過充氣孔充氣15ml~20ml,使其頭部的氣囊膨脹以固定在子宮角內腔的基部,以免沖卵液流入子宮體并沿子宮頸流出。
8.4.2 注入沖卵液
將D-PBSS 沖卵液吊瓶掛在距母牛外陰上方0.8m~1m高處,接三通管和沖卵管,用進流開關和出流開關控制流量,每次灌注30ml~50ml D-PBSS沖卵液,單側總量為300ml~500ml。也可用50ml一次性注射器分次注射和抽吸(劑量為30ml~50ml),具有相同的沖排效果。另側子官沖胚時應先重新插入鋼芯和放氣,將其移入另側子官角后用同樣方法沖胚。沖胚結束后放氣,將采卵管移入子宮體后,在子宮體推注抗生素(如土霉素100萬IU 或宮乳康10ml~20ml),肌注氯前列烯醇(PGC)0.4mg,間隔12h 后再用0.4mg。
9 胚胎檢查
9.1 檢胚
采用漏斗法接收回收液,靜置10min,等胚胎下沉后移去上層液,可將最后留在斗中的回收液倒入玻璃皿中直接撿胚,撿到胚胎應及時移入含有10%~20%犢牛血清的D-PBSS培養液中;進行凈化處理,對回收的胚胎進行形態學鑒定確定等級。
從回收液中撿胚可用實體顯微鏡放大16倍~20倍。將找到的胚胎用吸管撿出放入裝有D-PBSS保存液的器皿中,按順序依次輕輕吸胚、清洗,可先吸些D-PBSS吹向胚的周圍,使胚在液滴中翻騰,清除卵周圍的黏連物,一般需清洗3次。
9.2 胚胎質量鑒定
9.2.1 將凈化后的胚胎置于D-PBSS液中,放大40倍~200倍作形態學檢查。胚齡通常以母畜發情日為0天來計算,距發情日的天數即為胚齡。
9.2.2 胚胎發育特征
適于移植的胚胎胚齡為6d~8d,相對應的胚胎發育階段為桑椹胚至囊胚,其發育表現為:
9.2.2.1 桑椹胚
受精后第5d~6d 回收的胚胎,能觀察到球狀細胞團,分不清分裂球,占據透明帶內腔的大部分。
9.2.2.2 致密桑椹胚
受精后第6d~7d 回收的胚胎,細胞團變小,占透明帶內腔的60%~70%。
9.2.2.3 早期囊胚
受精后第7d~8d 回收的胚胎,細胞的一部分出現發亮的胚泡腔,細胞團占透明帶內腔的70%~80%,難以分清內細胞團和滋養層。
9.2.2.4 囊胚
受精后第7d~8d 回收的胚胎,內細胞團和滋養層界限清晰,胚泡腔明顯,細胞充滿透明帶內腔。
9.2.2.5 擴張囊胚
受精后第8d~9d 回收的胚胎,胚泡腔明顯擴大,體積增至原來的1.2倍~1.5倍,與透明帶之間無空隙,透明帶變薄,相當于正常厚度的1/3。
9.2.2.6 孵育胚
透明帶破裂,細胞團孵出透明帶。
9.2.3 胚胎的分級
9.2.3.1 1級 優良胚胎:形態典型,卵細胞和分裂球的輪廓清晰,細胞質致密,色調和分布極均一。
9.2.3.2 2級 普通胚胎:與典型的胚胎相比,稍有變形,但卵細胞和分裂球的輪廓清晰,細胞質較致密,分布均勻,變性細胞和水泡不超過10%~30%。
9.2.3.3 3級 不良胚胎:形態有明顯變異,卵細胞和分裂球輪廓稍不清晰,或部分不清晰,細胞質不致密,分布不均勻,色調發暗,突出的細胞、水泡和變性細胞占30%~50%。
9.2.3.4 4級 凡總體形態結構不正常的卵子,未受精的、退化的或破碎的卵子,透明帶空的或將要空的卵子,以及與正常胚齡相比,發育遲2d或2d以上的胚胎均難以繼續正常發育,不宜移植。
10 胚胎的裝管、冷凍和解凍
10.1 裝管
10.1.1 采用一步平衡法,
冷凍保存液為含10%甘油的D-PBSS液。將胚胎在基礎液(PBS+10%BSA 沖卵液)中洗滌5次~10次,在10%甘油第1液中平衡5min,在10%甘油第2液中平衡10min后裝管。
注:10%BSA 沖卵液:含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗
10.1.2 胚胎裝管方法:
將平衡好的胚胎用0.25ml 細管裝管備用。3 段法裝管的順序是:3cm 12.5%蔗糖PBS液、0.5cm氣泡、1.0cm10%甘油PBS液(含胚胎)、0.5cm氣泡、2cm12.5%蔗糖PBS液。用封口塞、聚乙醇粉末封口或熱封法將開口端封口,按程序進行冷凍。
10.2 冷凍
將裝入胚胎的細管放入0℃冷凍儀平衡10min,以1℃/min速度降溫,(-7~-6)℃誘發結晶,平衡10min。隨后將冷凍儀以0.5℃/min (O.3~O.8℃/min)降至-30℃,然后將冷凍后的胚胎分裝標記放入液氮罐中長期保存。
10.3 解凍
從液氮罐中取出胚胎細管,在空中停留1s,放入36~38℃水浴中停留10s解凍后,用生理鹽水清洗,剪去棉塞端,與帶有空氣的1ml注射器連接上。再剪去細管的另一端封口,將胚胎推到干燥潔凈器皿內。采用分步法脫除甘油,分別間隔5min,依次通過1摩爾、0.75摩爾、0.50摩爾、0.25摩爾的甘油磷酸鹽緩沖液,最后通過含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗2次~3次,去除甘油,移至不含甘油的PBS保存液中鏡檢待用。
10.4 胚胎細管標記
胚胎細管應標記和登記。存檔資料包括胚胎系譜、代碼、保存方法、應用單位。胚胎標記包括序列號、父本、母本、胚胎發育期和級別及數量、胚胎生產單位和胚胎生產日期。
11 胚胎移植
分為鮮胚移植和凍胚移植。
11.1 受體牛黃體檢查
要求受體牛發情時直腸檢查的卵泡直徑在10mm~20mm左右,發情后36h出現排卵。黃體發育達到一級和二級發育水平的才能進行胚胎移植。黃體發育程度判定條件如下:
11.1.1 一級黃體
黃體形態和發情天數一致,黃體呈乳頭狀突出于卵巢表面。黃體直徑2.0cm左右,約拇指大小,呈軟肉狀,排卵點火山口狀突起明顯。
11.1.2 二級黃體
黃體形態和發情天數基本一致。黃體直徑1.5cm 左右,約中指肚大小,呈硬肉狀,排卵點突起較明顯。
11.1.3 三級黃體
黃體直徑1.0cm 左右,手摸約小拇指大小,硬而突起不明顯。黃體發育不良的母牛應及時淘汰。
11.2 受體牛的準備
保定受體牛,清除便污,肌注2%靜松靈1ml或用2%的普魯卡因3ml在l~2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰,用高錳酸鉀水沖洗消毒,用滅菌紙擦干,最后經酒精棉球消毒。
11.3 器械準備
先將移植槍、槍頭及金屬保護外套分別用紙包扎好,高壓消毒。塑料卡蘇式移植槍需經氣體滅菌。移植時先用70%酒精棉球消毒裝有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,裝入移植槍內,套上保護外套。
11.4 移植前胚胎裝管
用0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液,中間由兩個氣泡隔開,中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段裝管,胚胎在中段。一步吸管法解凍脫甘油后,用酒精棉球多次消毒吸管,剪去封口即可用于移植。
11.5 移植
操作員一只手伸進直腸,另一只手持移植器插入陰道,移植器到達子宮頸口時,用力將移植槍捅破外套填片,插入子宮頸。在直腸內誘導使槍頭輕輕穩妥地插入黃體一側子宮角至大彎處,持移植器的手推出胚胎,緩慢旋轉地抽出移植槍。
12 妊娠診斷
采用外部觀察法和直腸檢查法,執行DB1505/T 074。